16 ottobre 2003
Aggiornamenti e focus
Dalla ricerca alla pratica: il DNA ricombinante
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Scoprire come era fatto il DNA non era sufficiente. Bisognava imparare a utilizzarlo, e ciò divenne chiaro negli anni 60.
Fino a quel momento il DNA era una molecola incredibilmente lunga e chimicamente monotona, alla quale era possibile approcciarsi solo per via indiretta, con il sequenziamento delle proteine o dell'RNA o con l'analisi genetica. Inoltre, mentre le proteine sono entità discrete, e facilmente isolabili, strutturalmente e funzionalmente, il gene è una piccola regione funzionale all'interno di una molecola molto più grande (nucleotide) e, per quanto sia possibile romperla meccanicamente in parti più piccole, tali frammenti rimarrebbero indistinguibili tra loro.
La soluzione a questi problemi si delinea con la scoperta degli enzimi di restrizione. Le nucleasi di restrizione sono proteine normalmente prodotte dai batteri per difendersi dagli attacchi virali: degradano il DNA del virus che ha invaso la cellula. Ogni nucleasi (ne esistono numerose forme) è in grado di riconoscere brevi ma specifiche sequenze nucleotidiche, da quattro a otto nucleotidi, come siti in cui eseguire il taglio, tecnicamente siti di restrizione.
Purificando e isolando questi enzimi si ottengono "forbici" altamente specifiche che permettono di suddividere il DNA in frammenti della doppia elica di dimensioni strettamente definite, in base alle quali possono essere separati.
Con questi strumenti è quindi possibile isolare i singoli geni di interesse. Inoltre alcuni di questi enzimi hanno la particolare caratteristica di eseguire dei tagli che lasciano le estremità del frammento con code a singolo filamento. Terminazioni di questo tipo vengono chiamate cohesive o sticky ends, in quanto ognuna delle due code può formare coppie di basi complementari con qualsiasi altra coda generata dallo stesso tipo di enzima di restrizione. Ciò significa che le terminazioni coesive permettono a due frammenti di DNA, prodotti dallo stesso tipo di nucleasi di essere facilmente uniti, la molecola di DNA risultante viene chiamata molecola di DNA ricombinante.
Una volta isolato, tuttavia, ogni singolo gene deve essere disponibile in quantità sufficienti per essere studiato e manipolato. Per questo motivo si procede con una tecnica chiamata reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction o PCR). La PCR ripercorre i meccanismi cellulari di replicazione del DNA in cui alcuni enzimi "srotolano" la doppia elica del DNA per separare i due filamenti. Poi, in corrispondenza dell'origine della replicazione, l'enzima RNA polimerasi sintetizza, un breve segmento di RNA complementare a singolo filamento. Questo segmento ibrido DNA/RNA agisce come "punto di innesco" per l'enzima, che sintetizza il filamento complementare allo stampo di DNA. Nel corso della PCR, si usa prima una temperatura elevata per separare i filamenti di DNA e poi una temperatura più bassa per formare gli inneschi ibridi (gli RNA primer vengono introdotti nel sistema in vitro) in regioni del filamento che comprendono il gene di interesse. A questo punto, la polimerasi riconosce gli inneschi e sintetizza a partire da questi un segmento di DNA corrispondente al gene di interesse, utilizzando nucleotidi di sintesi. A ogni ciclo quindi il numero di copie del gene raddoppia ottenendo un'amplificazione esponenziale.
Le numerose copie del gene così ottenute possono essere utilizzate per costruire altrettante molecole di DNA ricombinante.
Lo stesso risultato si ottiene, anche se con minor rapidità, procedendo con l'impiego di cellule e opportuni vettori. In questo caso si costruisce il DNA ricombinante utilizzando un vettore, solitamente un plasmide, una molecola circolare di DNA, che viene inserito nella cellula di un batterio, per esempio l'Escherichia coli. Il plasmide ha la capacità di autoreplicarsi, indipendentemente dalla replicazione del materiale genetico del batterio. Si formano così numerose copie della molecola ricombinante all'interno dei batteri.
Produrre farmaci col DNA
Queste tecniche hanno aperto nuove prospettive nel settore delle biotecnologie. La possibilità di isolare un gene e di spostarlo dalla sua molecola di DNA di origine e dalla cellula di origine, in un altro DNA e in un'altra cellula, si è dimostrata una risorsa preziosa per sviluppare applicazioni in numerosi campi. Sicuramente in medicina è stato possibile intervenire in modo nuovo su alcune malattie e nella produzione industriale di farmaci. La stessa terapia genica si basa proprio sulla possibilità di trasferire un gene "sano" per poter correggere, attivare o disattivare un gene difettoso.
In questo modo si possono inoltre ottenere vaccini più sicuri e efficaci isolando il gene che codifica per la proteina batterica o virale che agisce da antigene.
Inoltre sono numerosissimi i principi attivi ottenuti mediante DNA ricombinante, il primo dei quali fu l'insulina umana che nel 1982 fu prodotto a livello industriale utilizzando il batterio E. coli e vettori di espressione plasmidici. La portata di questa metodica è enorme. La possibilità di copiare con la massima precisione sostanze prodotte fisiologicamente allarga in maniera drammatica la possibilità di intervento del medico.
Se da una parte l'impiego del DNA ricombinante consente di proporre nuove soluzioni farmacologiche, dall'altra può aumentare la disponibilità di farmaci già noti.
Simona Zazzetta
Fino a quel momento il DNA era una molecola incredibilmente lunga e chimicamente monotona, alla quale era possibile approcciarsi solo per via indiretta, con il sequenziamento delle proteine o dell'RNA o con l'analisi genetica. Inoltre, mentre le proteine sono entità discrete, e facilmente isolabili, strutturalmente e funzionalmente, il gene è una piccola regione funzionale all'interno di una molecola molto più grande (nucleotide) e, per quanto sia possibile romperla meccanicamente in parti più piccole, tali frammenti rimarrebbero indistinguibili tra loro.
La soluzione a questi problemi si delinea con la scoperta degli enzimi di restrizione. Le nucleasi di restrizione sono proteine normalmente prodotte dai batteri per difendersi dagli attacchi virali: degradano il DNA del virus che ha invaso la cellula. Ogni nucleasi (ne esistono numerose forme) è in grado di riconoscere brevi ma specifiche sequenze nucleotidiche, da quattro a otto nucleotidi, come siti in cui eseguire il taglio, tecnicamente siti di restrizione.
Una forbice per la doppia elica
Purificando e isolando questi enzimi si ottengono "forbici" altamente specifiche che permettono di suddividere il DNA in frammenti della doppia elica di dimensioni strettamente definite, in base alle quali possono essere separati.
Con questi strumenti è quindi possibile isolare i singoli geni di interesse. Inoltre alcuni di questi enzimi hanno la particolare caratteristica di eseguire dei tagli che lasciano le estremità del frammento con code a singolo filamento. Terminazioni di questo tipo vengono chiamate cohesive o sticky ends, in quanto ognuna delle due code può formare coppie di basi complementari con qualsiasi altra coda generata dallo stesso tipo di enzima di restrizione. Ciò significa che le terminazioni coesive permettono a due frammenti di DNA, prodotti dallo stesso tipo di nucleasi di essere facilmente uniti, la molecola di DNA risultante viene chiamata molecola di DNA ricombinante.
Geni da fotocopiare
Una volta isolato, tuttavia, ogni singolo gene deve essere disponibile in quantità sufficienti per essere studiato e manipolato. Per questo motivo si procede con una tecnica chiamata reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction o PCR). La PCR ripercorre i meccanismi cellulari di replicazione del DNA in cui alcuni enzimi "srotolano" la doppia elica del DNA per separare i due filamenti. Poi, in corrispondenza dell'origine della replicazione, l'enzima RNA polimerasi sintetizza, un breve segmento di RNA complementare a singolo filamento. Questo segmento ibrido DNA/RNA agisce come "punto di innesco" per l'enzima, che sintetizza il filamento complementare allo stampo di DNA. Nel corso della PCR, si usa prima una temperatura elevata per separare i filamenti di DNA e poi una temperatura più bassa per formare gli inneschi ibridi (gli RNA primer vengono introdotti nel sistema in vitro) in regioni del filamento che comprendono il gene di interesse. A questo punto, la polimerasi riconosce gli inneschi e sintetizza a partire da questi un segmento di DNA corrispondente al gene di interesse, utilizzando nucleotidi di sintesi. A ogni ciclo quindi il numero di copie del gene raddoppia ottenendo un'amplificazione esponenziale.
Le numerose copie del gene così ottenute possono essere utilizzate per costruire altrettante molecole di DNA ricombinante.
Lo stesso risultato si ottiene, anche se con minor rapidità, procedendo con l'impiego di cellule e opportuni vettori. In questo caso si costruisce il DNA ricombinante utilizzando un vettore, solitamente un plasmide, una molecola circolare di DNA, che viene inserito nella cellula di un batterio, per esempio l'Escherichia coli. Il plasmide ha la capacità di autoreplicarsi, indipendentemente dalla replicazione del materiale genetico del batterio. Si formano così numerose copie della molecola ricombinante all'interno dei batteri.
Produrre farmaci col DNA
Queste tecniche hanno aperto nuove prospettive nel settore delle biotecnologie. La possibilità di isolare un gene e di spostarlo dalla sua molecola di DNA di origine e dalla cellula di origine, in un altro DNA e in un'altra cellula, si è dimostrata una risorsa preziosa per sviluppare applicazioni in numerosi campi. Sicuramente in medicina è stato possibile intervenire in modo nuovo su alcune malattie e nella produzione industriale di farmaci. La stessa terapia genica si basa proprio sulla possibilità di trasferire un gene "sano" per poter correggere, attivare o disattivare un gene difettoso.
In questo modo si possono inoltre ottenere vaccini più sicuri e efficaci isolando il gene che codifica per la proteina batterica o virale che agisce da antigene.
Inoltre sono numerosissimi i principi attivi ottenuti mediante DNA ricombinante, il primo dei quali fu l'insulina umana che nel 1982 fu prodotto a livello industriale utilizzando il batterio E. coli e vettori di espressione plasmidici. La portata di questa metodica è enorme. La possibilità di copiare con la massima precisione sostanze prodotte fisiologicamente allarga in maniera drammatica la possibilità di intervento del medico.
Se da una parte l'impiego del DNA ricombinante consente di proporre nuove soluzioni farmacologiche, dall'altra può aumentare la disponibilità di farmaci già noti.
Simona Zazzetta
